Filtrazzjoni tanġenzjali tal-Fluss TFF Magħquda Ma' Ultracentrifugazzjoni Għal Preparazzjoni Effiċjenti ta' Vesikuli Żgħar Extraċellulari

Vesicles żgħar extraċellulari (sEVs) huma vesicles nanoskala mnixxija minn ċelloli li fihom aċidi nuklejċi, proteini, molekuli żgħar, u komponenti oħra, u għandhom rwol importanti fil-komunikazzjoni interċellulari. Vesiċelli extraċellulari żgħar tat-tip Exosome-jaqsmu xebh kbir maċ-ċelloli ġenituri tagħhom. Meta mqabbla ma 'nanopartiċelli artifiċjali, juru rati ta' tneħħija immuni aktar baxxi u ċitotossiċità aktar baxxa, li jagħmluhom kandidati promettenti bħala ġoddavetturi tal-kunsinna tad-droga in vivo. Kważi kull tip ta 'ċelluli jistgħu inixxu dawn il-vesikoli, u r-riċerka dwar l-applikazzjoni tagħhom bħala trasportaturi tad-droga qed timxi gradwalment mil-laboratorju lejn applikazzjonijiet kliniċi. Madankollu,produzzjoni fuq skala kbira-tibqa' ostakolu kbir.

 

Metodi Kurrenti għall-Iżolament tal-Vezikuli Extraċellulari

Metodi attwali ta 'iżolament tal-vesikuli extraċellulari jinkluduultraċentrifugazzjoni, ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità, kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs-(SEC), u preċipitazzjoni tal-polyethylene glycol (PEG).

Il-preċipitazzjoni tal-PEG toffri rendiment għoli u tħaddim sempliċi, iżda hija assoċjata ma 'kontaminazzjoni sinifikanti minn proteini mhux mixtieqa. Iċ-ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità u l-kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs-jistgħu jipprovdu prodotti ta'-purità għolja, iżda l-effiċjenza tagħhom hija relattivament baxxa u l-proċessi jieħdu ħin-. L-ultraċentrifugazzjoni tintuża ħafna, iżda l-volum tal-ipproċessar tagħha huwa limitat mill-kapaċità taċ-ċentrifuga, li jagħmilha diffiċli biex tiżdied.

 

Applikazzjoni ta 'Filtrazzjoni tanġenzjali tal-Fluss għal Separazzjoni sEV

Filtrazzjoni tanġenzjali tal-fluss (TFF) diġà ġiet applikata għas-separazzjoni ta 'nanopartiċelli bħal liposomi u vettori lentivirali. F'TFF, l-għalf jiċċirkola b'mod tanġenzjali tul il-wiċċ tal-membrana, li jgħin inaqqas il-fouling tal-membrana u jagħmel il-proċess aktar faċli biex jiżdied.

Peress li l-vesikoli żgħar extraċellulari ġeneralment ivarjaw minn30–200 nmfid-dijametru, aCassette tal-membrana 0.45 μmjistgħu jintgħażlu fis-sistema TFF biex jitneħħew proteini u vesicles akbar, filwaqt li aCassette tal-membrana 300 kDajistgħu jintużaw biex jitneħħew proteini ta'-piż molekulari żgħir u jikkonċentraw il-vesikoli żgħar extraċellulari preżenti fil-medju tal-kultura.

 

Karatterizzazzjoni tal-Materja Prima wara Separazzjoni TFF

L-analiżi tat-traċċar tan-nanopartiċelli (NTA) wriet li d-dijametri tal-partiċelli kienu mqassma prinċipalment fil-medda ta’0–250 nm.

 

 

Madankollu, mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni (TEM) żvelat ammont kbir ta' proteina kontaminanti, filwaqt li ma ġew osservati l-ebda vesicles extraċellulari. Dawn ir-riżultati indikaw li pass addizzjonali ta 'purifikazzjoni downstream kien meħtieġ biex jippurifika aktar il-vesikoli extraċellulari.

 

Karatterizzazzjoni tal-Konċentrat TFF wara Ultrafiltrazzjoni ta' 100 kDa

Il-konċentrat TFF ġie pproċessat aktar bl-użu ta' aTubu ta 'ultrafiltrazzjoni ta' 100 kDa.

NTA wriet li d-dijametri tal-partiċelli fil-konċentrati miksuba wara rawnd wieħed u tnejn ta 'ultrafiltrazzjoni baqgħu prinċipalment fil-medda ta'0–250 nm. Madankollu, it-twettiq ta 'ultrafiltrazzjoni darbtejn irriżulta fi tnaqqis sinifikanti fin-numru ta' partiċelli miksuba.

L-analiżi tat-TEM wriet li l-ebda strutturi bħal vesiku-ma ġew osservati la f'konċentrati ta' ultrafiltrazzjoni ta'-darba jew ta' darba-, filwaqt li baqa' ammont konsiderevoli ta' proteina kontaminanti.

Għalhekk,L-ultrafiltrazzjoni ta '100 kDa ma setgħetx tintuża b'mod effettiv biex tippurifika l-mezz tal-kultura wara l-konċentrazzjoni tat-TFF.

 

 

Karatterizzazzjoni tal-Konċentrat TFF Purifikat permezz ta 'Ultracentrifugation

NTA wera li d-dijametri tal-partiċelli tal-prodotti purifikati kienu prinċipalment imqassma fil-medda ta '0–250 nm.

B'mod importanti, TEM żvela b'mod ċar strutturi bħal vesicle-f'oqsma differenti ta' viżjoni. Dawn ir-riżultati wrew li wara li kkonċentra l-mezz tal-kultura bl-użu tat-TFF,l-ultraċentrifugazzjoni tista' tiġi sussegwentement użata għal aktar separazzjoni u purifikazzjoni ta' veżikoli extraċellulari.

 

 

Karatterizzazzjoni ta' sEVs Iżolati minn Medju Kundizzjonat ta' Ċelloli Stem Mesenchymal Bl-użu ta' TFF Magħquda ma' Ultracentrifugazzjoni

NTA wera li d-dijametri tal-partiċelli tal-prodotti purifikati kienu prinċipalment imqassma fil-medda ta '0–250 nm.

Ġew osservati strutturi bħal vesiku-mit-TEM. L-analiżi tal-western blot wriet espressjoni pożittiva tal-proteini assoċjati mal-vesikule extraċellulari-CD9, CD63, u ALIXfil-vesikoli extraċellulari purifikati.

Dawn ir-riżultati kkonfermaw li l-vesikoli extraċellulari żgħar purifikati kien fihom eżosomi, li jindikaw li dan il-metodu jista 'jintuża wkoll għaliżolament u estrazzjoni exosome.

 

 

Konklużjoni: TFF Magħquda ma' Ultraċentrifugazzjoni għal Preparazzjoni sEV ta'-Kwalità Għolja

L-istudju wera likonċentrazzjoni TFF waħedhairriżulta fi prodott li kien fih ammont konsiderevoli ta’ proteini li jikkontaminaw u għalhekk kien insuffiċjenti biex jinkisbu vesikuli extraċellulari kwalifikati.

Bl-istess mod, bl-użu ta' aTubu ta 'ultrafiltrazzjoni ta' 100 kDa għal purifikazzjoni sekondarjama wasslux b'mod effettiv strutturi tal-vesikuli intatti.

Billi tgħaqqad il-konċentrazzjoni TFF ma 'purifikazzjoni sussegwenti ta' ultraċentrifugazzjoni, il-vantaġġi taż-żewġ tekniki jistgħu jiġu integrati biex jinkisbuprodotti ta' vesiċelli extraċellulari żgħar ta'-kwalità għolja.

Meta mqabbel ma 'ultraċentrifugazzjoni konvenzjonali biss, il-proċess magħqud jista' b'mod effettivtnaqqas il-ħin tal-ipproċessar ġenerali u ttejjeb l-effiċjenza tas-separazzjoni.

F'dan il-fluss tax-xogħol,TFF jippermetti arrikkiment rapidu ta'-kampjuni ta' volum kbir, tindirizza l-limitazzjoni ta 'ultracentrifugazzjoni konvenzjonali fl-ipproċessar ta' volumi kbar ta 'kampjuni. L-ultraċentrifugazzjoni mbagħad twettaq purifikazzjoni profonda biex tneħħi l-impuritajiet tal-proteini ko-konċentrati filwaqt li tgħin biex iżżomm il-purità u l-integrità tal-vesikoli.

Barra minn hekk, il-proċess ma jeħtieġx iż-żieda ta 'reaġenti ta' preċipitazzjoni kimika eżoġena, tgħin biex tippreserva l-attività bijoloġika tal-vesikoli sa l-akbar punt possibbli.

Mill-perspettiva tat-traduzzjoni industrijali, dan il-proċess għandu sinifikantiiżidu-potenzjalu jista 'jgħin biex jindirizzaw l-isfidi assoċjati mal-produzzjoni fuq skala kbira-ta' vesikuli extraċellulari għalkunsinna tad-droga, mediċina riġenerattiva, u żvilupp ta 'prodotti relatati. Jipprovdi wkoll bażi sperimentali soda għall-ottimizzazzjoni sussegwenti tal-proċess u l-manifattura fuq skala pilota-.

 

Referenza

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, et al.Stabbiliment ta 'Metodu għas-Separazzjoni ta' Vesicles Extraċellulari Żgħar permezz ta 'Filtrazzjoni tanġenzjali tal-Fluss Magħquda ma' Ultracentrifugazzjoni. Ġurnal Ċiniż tal-Bijoloġiċi, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.